CCK-8試劑盒(細胞增殖及毒性檢測)

Cell Counting Kit-8 簡(jiǎn)稱(chēng)CCK-8 試劑盒，為MTT 法的替代方法，是一種基于WST（水溶性四唑鹽，化學(xué)名：2-(2-甲氧基-4-硝苯基)-3-(4-硝苯基)-5-(2,4-二磺基苯)-2H-四唑單鈉鹽）的廣泛應用于細胞增殖和細胞毒性的快速高靈敏度檢測試劑盒?？捎糜谒幬锖Y選、細胞增殖測定、細胞毒性測定、腫瘤藥敏等試驗。

使用說(shuō)明：
一、制作標準曲線(xiàn)（測定細胞具體數量時(shí) （測定細胞具體數量時(shí)）
1、先用細胞計數板計數所制備的細胞懸液中的細胞數量，然后接種細胞。
2、按比例依次用培養基等比稀釋成一個(gè)細胞濃度梯度，一般要做 3-5 個(gè)細胞濃度梯度，每組 3-6 個(gè)復孔。
3、接種后培養至細胞貼壁，然后加 CCK-8 試劑培養一定時(shí)間后測定 OD 值，制作出一條以細胞數量為橫坐標（X 軸），OD 值為縱坐標（Y 軸）的標準曲線(xiàn)。根據此標準曲線(xiàn)可以測定出未知樣品的細胞數量（試用此標準曲線(xiàn)的前提是實(shí)驗的條件要一致，便于確定細胞的接種數量以及加入 CCK-8 后的培養時(shí)間。）

二、細胞活性檢測

1、在 96 孔板中接種細胞懸液（100µL/孔）。將培養板放在培養箱中預培養（在 37℃,5% CO2 的條件下）。

2、向每孔加入 10µL CCK-8 溶液（注意不要在孔中生成氣泡，它們會(huì )影響 OD 值的讀數）。

3、將培養板在培養箱內孵育 1-4 小時(shí)。

4、用酶標儀測定在 450nm 處的吸光度。

5、如果暫時(shí)不測定 OD 值，打算以后測定的話(huà)，可以向每孔中加入 10µL 0.1M 的 HCl 或者 1%SDS(W/V)溶液，并遮蓋培養板避光保存在室溫條件下。在 24 小時(shí)內吸光度不會(huì )發(fā)生變化。

三、細胞增值-毒性檢測

1、在 96 孔板中配置 100 µL 的細胞懸液。將培養板在培養箱預培養 24 小時(shí)（在 37 ℃，5% CO2 的條件下）。

2、向培養板加入 10µL 不同濃度的待測物質(zhì)。在培養箱孵育一段適當的時(shí)間（例如：6、12、24 或 48 小時(shí)）。

3、向每孔加入 10 µL CCK-8 溶液（注意不要在孔中生成氣泡，它們會(huì )影響 OD 值的讀數）。如果待測物質(zhì)有氧化性或還原性的話(huà)，可在加 CCK-8 之前更換新鮮培養基（除去培養基，并用培養基洗滌細胞兩次，然后加入新的培養基），去掉藥物影響。

4、將培養板在培養箱內孵育 1-4 小時(shí)。

5、用酶標儀測定在 450 nm 處的吸光度。

6、如果暫時(shí)不測定 OD 值，打算以后測定的話(huà)，可以向每孔中加入 10µL 0.1M 的 HCl 或者 1%SDS(W/V)溶液，并遮蓋培養板避光保存在室溫條件下。在 24 小時(shí)內吸光度不會(huì )發(fā)生變化。

活力計算：.

細胞活力（％）=[A(加藥)－A(空白)]／[ A(0 加藥)－A(空白)]×100

A（加藥）：具有細胞、CCK-8 溶液和藥物溶液的孔的吸光度

A（空白）：具有培養基和 CCK-8 溶液而沒(méi)有細胞的孔的吸光度

A（0 加藥）：具有細胞、CCK-8 溶液而沒(méi)有藥物溶液的孔的吸光度

細胞活力：細胞增殖活力或細胞毒性活力

注意事項：

①建議先做幾個(gè)孔摸索接種細胞的數量和加入 CCK-8 試劑后的培養時(shí)間。

②白細胞可能需要培養較長(cháng)時(shí)間。

③當使用標準 96 孔板時(shí)，貼壁細胞的最小接種量至少為 1 ,000 個(gè)/孔 (100 µL 培養基)。檢測白細胞時(shí)的靈敏度相對較低，因此推薦接種量不低于 2,500 個(gè)/孔 ( 100 µL 培養基)。如果要使用 24 孔板或 6 孔板實(shí)驗，請先計算每孔相應的接種量，并按照每孔培養基總體積的 10% 加入 CCK-8 溶液。

④如果沒(méi)有 450nm 的濾光片，可以使用吸光度在 430-490 nm 之間的濾光片，但是 450nm 檢測靈敏度最高。

⑤培養基中酚紅的吸光度可以在計算時(shí)，通過(guò)扣除空白孔中本底的吸光度而消去，因此不會(huì )對檢測造成影響。