xl-Eh0171 人干擾素-a（IFN-a）ELISA試劑盒 xlpcc試劑盒 96T

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Elisa試劑盒產(chǎn)品規格：48T/96T

Elisa試劑盒產(chǎn)品報價(jià)：1600元/2300元

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ELISA方法詳細過(guò)程及步驟

ELISA試劑盒是酶聯(lián)接免疫吸附劑測(Enzyme-LinkedImmunosorbnentAssay)的簡(jiǎn)稱(chēng)。它是繼免疫熒光和放射免疫技術(shù)之后發(fā)展起來(lái)的一種免疫酶技術(shù)。此項技術(shù)自70年代初問(wèn)世以來(lái)，發(fā)展十分迅速，目前已被廣泛用于生物學(xué)和醫學(xué)科學(xué)的許多領(lǐng)域。

(一)　原理

ELISA是以免疫學(xué)反應為基礎，將抗原、牽9體的特異性反應與酶對底物的高效催化作用相結合起來(lái)的一種敏感性很高的試驗技術(shù)。由于抗原、抗體的反應在一種固相載體──聚苯乙烯微量滴定板的孔中進(jìn)行，每加入一種試劑孵育后，可通過(guò)洗滌除去多余的游離反應物，從而保證試驗結果的特異性與穩定性。在實(shí)際應用中，通過(guò)不同的設計，具體的方法步驟可有多種。即:用于檢測抗體的間接法(圖a)、用于檢測抗原的雙抗體夾心法(圖b)以及用于檢測小分子抗原或半抗原的抗原競爭法等等。比較常用的是ELISA雙抗體夾心法及ELISA間接法。

(二)　操作步驟

方法一　用于檢測未知抗原的雙抗體夾心法:

1.　包被：用0.05MPH9.牰碳酸鹽包被緩沖液將抗體稀釋至蛋白質(zhì)含量為1～10μg／ml。在每個(gè)聚苯乙烯板的反應孔中加0.1ml，4℃整夜。次日，棄去孔內溶液，用洗滌緩沖液洗3次，每次3分鐘。(簡(jiǎn)稱(chēng)洗滌，下同)。

2.　加樣：加一定稀釋的待檢樣品0.1ml于上述已包被之反應孔中，置37℃孵育1小時(shí)。然后洗滌。(同時(shí)做空白孔，陰性對照孔及陽(yáng)性對照孔)。

3.　加酶標抗體：于各反應孔中，加入新鮮稀釋的酶標抗體(經(jīng)滴定后的稀釋度)0.1ml。37℃孵育0.5～1小時(shí)，洗滌。

4.　加底物液顯色：于各反應孔中加入臨時(shí)配制的TMB底物溶液0.1ml，37℃10～30分鐘。

5.　終止反應：于各反應孔中加入2M硫酸0.05ml。

6.　結果判定：可于白色背景上，直接用肉眼觀(guān)察結果：反應孔內顏色越深，陽(yáng)性程度越強，陰性反應為無(wú)色或極淺，依據所呈顏色的深淺，以“+”、“-”號表示。也可測O·D值：在ELISA檢測儀上，于450nm(若以ABTS顯色，則410nm)處，以空白對照孔調零后測各孔O·D值，若大于規定的陰性對照OD值的2.1倍，即為陽(yáng)性。

方法二　用于檢測未知抗體的間接法：

用包被緩沖液將已知抗原稀釋至1～10μg／ml，每孔加0.1ml，4℃整夜。次日洗滌3次。加一定稀釋的待檢樣品(未知抗體)0.1ml于上述已包被之反應孔中,置37℃孵育1小時(shí),洗滌。(同時(shí)做空白、陰性及陽(yáng)性孔對照)于反應孔中，加入新鮮稀釋的酶標第二抗體(抗抗體)0.1ml，37℃孵育30-60分鐘，洗滌,zui后一遍用DDW洗滌。其余步驟同“雙抗體夾心法”的4、5、6。

(三)　試劑器材

1.　試劑

(1)　包被緩沖液(PH9.60.05M碳酸鹽緩沖液):

NaCO３　　　　1.59克

NaHCO３　 2.93克

加蒸餾水至1000ml

(2)　洗滌緩沖液(PH7.4PBS)：0.15M

KH2PO4　　　　 　0.2克

Na2HPO４·12H2O　　2.9克

NaCl　　　　　　　 8.0克

KCl　　　　　　　　0.2克

Tween-20　0.05％　 0.5ml

加蒸餾水至1000ml

(3)　稀釋液：

牛血清白蛋白(BSA)0.1克加洗滌緩沖液至100ml或以羊血清、兔血清等血清與洗滌液配成5～10％使用。

(4)　終止液(2M　H２SO４)：蒸餾水178.3ml，逐滴加入濃硫酸(98％)21.7ml。

(5)　底物緩沖液(PH5.0磷酸棗檸檬酸):0.2MNa２HPO４(28.4克／L)25.7ml0.1M檸檬酸(19.2克／L)24.3ml加蒸餾水50ml。

(6)　TMB(四甲基聯(lián)苯胺)使用液:TMB(10mg／5ml無(wú)水乙醇)0.5ml底物緩沖液(PH5.5)10ml

0.75％H２O２　　　32μl

(7)　ABTS使用液:

ABTS　　　　　　　　0.5mg

底物緩沖液(PH5.5)　1ml

3％H２O２　　2μl

(8)　抗原、抗體和酶標記抗體。

(9)　正常人血清和陽(yáng)性對照血清。

2.　器材:

(1)　聚苯乙烯塑料板(簡(jiǎn)稱(chēng)酶標板)40孔或96孔，ELISA檢測儀，50μl及100μl加樣器，塑料滴頭，小毛巾，洗滌瓶。

(2)　小燒杯、玻璃棒、試管、吸管和量筒等。

(3)　4℃冰箱，37℃孵育箱。

(四)　注意事項

1.　正式試驗時(shí)，應分別以陽(yáng)性對照與陰性對照控制試驗條件，待檢樣品應作一式二份，以保證實(shí)驗結果的準確性。有時(shí)本底較高，說(shuō)明有非特異性反應，可采用羊血清、兔血清或BSA等封閉。

2.　在ELISA中，進(jìn)行各項實(shí)驗條件的選擇是很重要的，其中包括:

(1)　固相載體的選擇：許多物質(zhì)可作為固相載體，如聚氯乙烯、聚苯乙烯、聚丙酰胺和纖維素等。其形式可以是凹孔平板、試管、珠粒等。目前常用的是40孔聚苯乙烯凹孔板。不管何種載體，在使用前均可進(jìn)行篩選：用等量抗原包被，在同一實(shí)驗條件下進(jìn)行反應，觀(guān)察其顯色反應是否均一性，據此判明其吸附性能是否良好。

(2)包被抗體(或抗原)的選擇：將抗體(或抗原)吸附在固相載體表面時(shí)，要求純度要好,吸附時(shí)一般要求PH在9.0～9.6之間。吸附溫度，時(shí)間及其蛋白量也有一定影響,一般多采用4℃18～24小時(shí)。蛋白質(zhì)包被的zui適濃度需進(jìn)行滴定：即用不同的蛋白質(zhì)濃度(0.1、1.0和10μg／ml等)進(jìn)行包被后，在其它試驗條件相同時(shí)，觀(guān)察陽(yáng)性標本的OD值。選擇OD值zui大而蛋白量zui少的濃度。對于多數蛋白質(zhì)來(lái)說(shuō)通常為1～10μg／ml。

(3)　酶標記抗體工作濃度的選擇：首先用直接ELISA法進(jìn)行初步效價(jià)的滴定(見(jiàn)酶標記抗體部份)。然后再固定其它條件或采取“方陣法”(包被物、待檢樣品的參考品及酶標記抗體分別為不同的稀釋度)在正式實(shí)驗系統里準確地滴定其工作濃度。

(4)　酶的底物及供氫體的選擇：對供氫體的選擇要求是價(jià)廉、安全、有明顯地顯色反應，而本身無(wú)色。有些供氫體(如OPD等)有潛在的致癌作用，應注意防護。有條件者應使用不致癌、靈敏度高的供氫體，如TMB和ABTS是目前較為滿(mǎn)意的供氫體。底物作用一段時(shí)間后，應加入強酸或強堿以終止反應。通常底物作用時(shí)間，以10-30分鐘為宜。底物使用液必須新鮮配制，尤其是H2O2在臨用前加入。